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艾滋病疫苗研究进展 | 【字体：小 大】 |
艾滋病疫苗研究进展 |
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作者：转载 文章来源：中国疾病预防控制中心 点击数： 更新时间：2006-6-22 |
艾滋病,全称为获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode2ficiency syndrome ,AIDS) , 是由人类免疫缺陷病毒(Human immun2odeficiency virus ,HIV) 引起的全身性疾病, 是20 世纪危害人类健康和生命最严重的病毒疾病之一。1981 年在美国首先报道该病, 1982 年由美国疾病病控制中心(CDC) 正式对该病命名,1983 年Barre - Sinoussi 分离到HIV。艾滋病主要通过血液、性接触及母婴传播传染。机体感染了HIV 后, 将造成持续性的免疫功能低下、免疫缺陷, 并引发一系列的免疫缺陷综合征,即艾滋病, 最终导致死亡。
自美国CDC 报道首例艾滋病后, 至今遍布世界五大洲,报告的AIDS 病例数已超过200 万, HIV 感染者近5 000 万人,而且已有1 000 多万人死于艾滋病, 截至今年6 月底, 我国累计报告的HIV 感染者26 058 例, 其中AIDS 1 111 例, 584 例已死亡。艾滋病已成为全球关注的公共卫生和社会热点问题,艾滋病的预防与治疗也成为当代科学的前沿之一。
当前最新的抗HIV 复合药物已有了很大的进展, 但治疗费用昂贵, 数量和效果有限, 绝大部分患者还无法承受,要控制并最终消灭HIV , 最有效的方法是制备疫苗, 虽然现有的疫苗还不能有效地刺激肌体产生广泛中和HIV 毒株的抗体,但基于过去制备病毒性疫苗的成功经验及对HIV 生物学和病理学的认识, 特别是对HIV 包膜蛋白结构的研究进展, 制备出更安全、更有效的HIV 疫苗已为期不远了。
1 艾滋病的病原学
艾滋病的病原体是HIV , HIV 属于逆转录病毒科(Retroviri2dae) 的慢病毒亚科(Lentiviruses) 。感染后HIV 病毒主要在人的淋巴系统复制, 增殖, 再释放入血液, 使人的免疫功能严重受损, 最后, 往往死于不可治愈的机会感染, 如卡氏肺囊虫肺炎, 或罕见的肿瘤如波氏肉瘤等。
根据遗传学和血清学的特征, HIV 分为HIV - 1 和HIV - 2两型。两者核酸序列相差40 % , HIV - 1 型对人的致病性、传染性、肌体复制能力、母婴传播概率、引起临床症状的严重程度均比后者强; 不少地区包括中国在内, 均发现一个人同时感染上HIV - 1 和HIV - 2。目前用猴艾滋病毒(SIV) 种系发现人类感染进化史, 再用生物数理方法推算, 认为SIV 是HIV - 1 和HIV - 2 来源, 从猴到人病毒的传导时间在30 年代左右, 对20 多种SIV 研究结果, 发现一些已能在人的白细胞中生长, 推测可能对人类致病的HIV 还可能存在HIV - 3、HIV - 4 或更多。
世界上流行的HIV/ AIDS , 根据其病毒原因, 特别是gp120V3 环进行PCR 扩增及序列测定, 已确定HIV - 1 有3 组12 个亚型, 即M 组的A、B、C、D、E、F、G、H、I 和J 亚型; O 组的O 亚型和N 组的O 亚型。HIV - 2 也至少有6 个亚型。不同国家和地区有其优势亚型。
2 HIV 的分子生物学
HIV 为逆转录病毒中的一员, 它具有逆转录病毒共有的特征, 包括核糖核酸组成的基因组由: 编码核心蛋白(gag) 、病毒的聚合酶类(pol) 及被膜蛋白(env) 三个多蛋白基因所组成的一般性病毒结构。
成熟的HIV 病毒颗粒在电镜下呈球形, 类似20 面体结构, 直径约90～150 nm , 毒粒外层是由脂双层膜构成的被膜,也称外膜或包膜, 其外面有突起, 由外膜糖蛋白gp120 和gp41构成, 插入被膜中的称跨膜糖蛋白, 主要由gp41 组成, gp120是主要包膜糖蛋白, 在病毒吸附与穿入靶细胞中起重要作用,gp41 也参与这一过程。被膜内面为p18/ p17 蛋白构成的核壳,其内为P24 蛋白, 由它包裹着核心蛋白、酶类(逆转录酶、RNaseH、整合酶和蛋白酶) 及作为基因组的两条RNA。
gag 基因前体蛋白p55 可水解成主要核心蛋白p24 , p18 和p15 ; pol 基因编码HIV 的逆转录酶(产物为p65/ p51) 和内切酶(产物为p32) ; env 基因前体糖蛋白gp160 可裂解成gp120 和gp41。
HIV 基因组由两条相同的单链正股RNA 组成, 每条含9 213 bp , 其前病毒(provirus) 长9 749 bp , 不同毒株所含碱基数不同。基因组含有gag、pol 、env 3 个结构基因以及tat 、rev、vef 、vif 、vpr、vpu、vpx 6 个调节基因。
HIV 显著的生物学特征是: 对CD4 T 细胞有明显嗜性, 特异地侵染人体免疫细胞, 造成免疫系统缺损, 导致各种机会性感染和肿瘤的发生, 从而引发AIDS; HIV 本身带有逆转录酶, 通过逆转录和整合作用, 可造成无症状潜伏感染致使受感染者携带病毒; HIV 基因组具有高度的变异性, 非常容易产生变异株; 一般的逆转录病毒只侵染处于分裂状态的细胞,而HIV 不仅如此, 还能侵染非分裂状态的细胞, 如巨噬细胞等; HIV 基因组的复制、转录、表达等过程受自身编码的酶、蛋白或因子以及调控序列的调控。
3 实验动物模型
制备疫苗, 适当的动物模型是必要的。许多HIV - 1 的原始毒株经黑猩猩(chimpanzee) 传代后在黑猩猩体内高水平的复制, 并引起CD4 阳性淋巴细胞的丢失, 诱发艾滋病样的综合征。
在使用黑猩猩的疫苗研究中, 完整的失活病毒及纯化的重组env、gag、nef 和vif 抗原与V3 体合成肽结合表明, 可保护少数黑猩猩免于HIV - 1 ⅢB 隔离体的侵害, 在更细致的研究中发现, 含有重组HIV - 1 gp120 而非gp160 的疫苗接种表明可保护黑猩猩免于ⅢB 感染。有gp120V3 环形区单克隆抗体的黑猩猩的免疫作用可使动物免于感染, 这表明单独的抗体即能产生保护。美国科学家用一种以DNA 疫苗为基础的新疫苗, 来尝试阻止HIV 感染黑猩猩, 结果, 他们的DNA 疫苗能够阻断HIV 的持续感染, 并获得了前所未有的效果。研究人员给3 只黑猩猩注射疫苗后, 跟踪研究48 周, 发现对照动物血中的病毒拷贝数远高于接种疫苗的动物, 说明疫苗在动物体内, 发挥了极大的作用。但迄今为止, 这些疫苗尚不能使人类预防HIV 感染。虽然黑猩猩是检验疫苗的理想模型,但由于黑猩猩是受保护物种, 只能用有限的数量来进行实验,这限制了它们用于疫苗的研究。
现今疫苗的研制进一步过渡到用类似HIV 的动物免疫缺陷征病毒, 如SIV 和猫免疫缺陷病毒( FIV) 等。SIV 在其天然寄主体内无致病性, 但有些原毒株在亚洲猕猴(asian macaquemonkey) 体内能持续性的高水平复制, 并诱发类艾滋病症状。近期SIV 模型已广泛用于HIV 疫苗的研究, 并取得一些进展。由于HIV 与SIV 在包膜结构和抗原性之间存在较大差异, 使该模型的实用又有较大的局限性。近年来, 人们用HIV - 1 和SIV 重组了嵌合病毒( SHIV) , 来克服致病机理中的物种障碍。以SIV 的基因组为背景表达HIV 的包膜蛋白, SHIV 在亚洲猕猴体内传代后, 可持续性高水平复制, 并引起CD4 阳性细胞的丢失, 和因机会性感染引起的死亡。SHIV 感染模型较SIV 感染模型前进了一大步。
4 HIV 疫苗的种类
在发展任何一种抗病毒疫苗中, 疫苗的安全性问题都是首要的。因此所有用于人体待选疫苗都要经过Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验。1986 年全球开始研制HIV 疫苗, 但是由于HIV 其本身所特有的特点, 研制HIV 疫苗有很大的难度。根据以往制取各种、各类病毒性疫苗的经验, 及HIV 核心蛋白p17 的86～115 位氨基酸之间有一个中和表位, 该肽的抗体能中和HIV 感染并能抑制病毒的复制, p24 抗原能使辅助性T 淋巴细胞活化, 发挥预防感染的作用等这些部位的功能, 正在研制疫苗, 现在大约有12 种疫苗正在进行临床试验, 其中,重组双价(B/ B) gp120 疫苗及另一种非B 亚型gp120 疫苗已分别在北美和泰国进行Ⅲ期临床试验。下面将已用于临床试验的几种疫苗作一简述。
4.1 HIV 灭活病毒粒子疫苗(inactivated viruses) : 经验证明,用各种佐剂携带灭活的完整病毒粒子作为疫苗, 可在人体内产生抗病毒免疫。用SIV 灭活疫苗接种黑猩猩后, 再用大剂量的SIV 攻击, 动物体内出现抗SIV 抗体, SIV 逐渐从血液中消失, 而对照动物病情不断恶化, 最终死亡。将灭活的HIV疫苗注射病人后, 可使病人血清阳转, 但不少人对这种灭活的疫苗的安全性表示怀疑, 而且, 目前还难以证实这种疫苗能否有效地诱导机体产生抗HIV 的细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)免疫应答。
4.2 减毒活病毒疫苗(live ,attenuated vaccines) : 对活病毒进行改造, 减少其致病性, 并用作疫苗可以产生与天然病毒相同的细胞免疫和体液免疫。早在1992 年就有学者提出此疫苗的设想, 并在恒河猴中进行验证。Hayami 等用基因突变的方法使HIV - 1/ SIV 减毒, 期望这种减毒疫苗能够用于人体实验, 而且目前在治疗艾滋病的医生中也有主张推行活疫苗试验的。但有些学者对减毒活疫苗的安全性表示怀疑, 由于HIV - 1 是变异快的病毒, 人们始终担心这种减毒活疫苗的潜在的恢复其致病性的能力, 但大多数学者的意见是应当继续加强对HIV 减毒活疫苗的研究。
4.3 合成肽疫苗: 用HIV - 1 env V3 区合成肽制备的单克隆抗体(McAb) 在体外能部分抑制gp120 与CD4 分子的结合, V3 肽可以刺激动物和人产生抗HIV 中和抗体和CTL 应答。最近有资料说明, 给11 名HIV 血清阴性个体注射p17 合成肽疫苗,结果受试者的细胞免疫应答均得到明显增强, 但由于V3 区的氨基酸排列在不同株间有一定差异, 使研究疫苗有一定的困难。
4.4 活载体疫苗(live vectorbased vaccines) : 将编码病毒蛋白的基因插入其他病毒或细胞基因组中并用之感染动物或人体,可产生对基因产物及载体的免疫反应。这种基于重组有机体的疫苗具有潜在的免疫原性, 而无原病毒引起的病理反应。
目前较为理想的活载体疫苗是以痘苗病毒(pox viruses) 和金丝雀痘病毒(canary pox vectors) 为载体的重组疫苗。将HIV 基因插入痘病毒基因组中, 并感染猕猴, 猕猴体内产生了针对HIV的特异性细胞和体液免疫反应。一个表达多种B 亚型HIV 蛋白的重组痘苗载体在美国已经进入1 期试验。金丝雀痘病毒是天花病毒的一种非致病性近亲, 它能进入人体细胞但不能组装成新的病毒粒子, 以它为载体, 插入HIV - 1 包膜蛋白基因和gag 基因, 并用其对300 多名志愿者进行免疫, 可在70 % 的人中检测到低滴度的对包膜蛋白和gag 的特异性抗体,29 % 的人中可测到特异性的细胞免疫应答。在美国一些重组的金丝雀痘病毒已经进入Ⅰ期和Ⅱ期临床试验, 并证明这种疫苗是安全的。还有报道用腺病毒的单链RNA 病毒作载体的HIV 疫苗, 腺病毒具有产生粘膜免疫的能力, 而粘膜免疫对防止HIV 感染是非常重要的, 在研究中将选用那些缺失了更多有害基因的, 已用于基因治疗的腺病毒载体。
4.5 核酸疫苗: 核酸疫苗是近年来HIV 疫苗研究的热点之一, 包括DNA 疫苗和RNA 疫苗, 用插入并表达免疫基因的质粒DNA 直接注射到体内是一种有效的疫苗途径。用由HIV 抗原基因和作为真核细胞表达载体构成的重组质粒免疫动物,可诱导的特异性抗体产生, 同时还观察到特异性T 淋巴细胞增殖应答和CTL 应答。这种疫苗最大的优点是兼有亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗的有效性, 在防治HIV 感染中具有良好的前景。HIV 核酸疫苗在美国已被批准进入临床试验, 如已有HIV - 1 的DNA 疫苗进入人体试验阶段。虽然核酸疫苗也存在安全问题, 但核酸疫苗以天然抗原形式被免疫系统识别可激活全面持久的细胞免疫和体液免疫, 且易于构建,热稳定性好, 不在体内复制等优点而引起人们的广泛兴趣。
4.6 亚单位巨分子颗粒化疫苗: 这种疫苗是有一种或一种以上, 但又不是全部HIV 蛋白非传染性颗粒构成的疫苗。如gag蛋白, 它是HIV 的主要结构蛋白之一, 它既能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫, 又能自我装配成病毒样粒子, 而且这种自我装配的功能不因外源基因的嵌合而丧失, 即使在病毒粒子的其他成分缺失的情况下, 仍具有自我装配的功能, 用这种病毒样粒子作疫苗既安全又能向免疫系统呈示与天然病毒颗粒相同的抗原, 能诱导机体产生持久的免疫应答。目前,对巨分子颗粒化疫苗的研究主要是对gag、gag - pol、gag - env及gag - pol - env 的重组基因表达, 其中gag - env 是目前研究的热点。人们对gag 蛋白之间如何互相结合, 最后形成病毒颗粒了解甚少, 这影响了此类疫苗的研究进程, 但这类疫苗是HIV 疫苗研究的一个很有潜力的领域。
4.7 抗独特型抗体疫苗: 抗独特型( Ⅰd) 抗体, 是另一种新型HIV 疫苗, 它是将抗独特型的抗体用于替代某种抗原作为免疫原, 所以它不含HIV 基因和蛋白。和抗原结合的抗体的V 区部位, 具有模拟抗原决定族的空间构象, 它在体内会起到和抗原相似的作用, 也刺激机体产生相应的抗体。如用HIVgp120 的中和抗体和抗CD4 单克隆抗体为抗原, 经两条途径制备抗Ⅰd 疫苗, 现在CD4 Ⅰd 抗体疫苗已开始进行Ⅱ期临床试验。
此外, 还有可溶性CD4 分子疫苗、治疗性疫苗等, 特别是治疗性疫苗, 它是针对被病原体感染的无症状携带者或已发病者而应用的一类新型疫苗, 这类疫苗是在综合病原学与免疫学理论基础上并结合应用研究而开发的一个新兴领域,该领域的研究进展很快, 具有广阔的前景。
从1996 年, 我国也开始了“中国新型艾滋病疫苗”的研究, 研究者率先分离了我国流行的艾滋病的特殊病毒株, 并针对这些病毒开始疫苗研究。我国疫苗研究的设计是在系统地研究我国艾滋病毒的基础上, 取材于流行于我国的艾滋病代表毒株, 针对我国人群的免疫反应和遗传背景而作技术改进。在技术路线上, 我国的艾滋病疫苗是用复合病毒颗粒,改进了国外只是单一蛋白的结构; 借用了与艾滋病同属慢病毒的马传染病贫血病毒疫苗的成功经验, 其相同的基因结构对艾滋病有很好的借鉴作用。此外, 我国利用痘病毒所研制的活载体疫苗也取得较大的进展。这些疫苗即将进行第一期人体实验, 时间为1 至2 年, 随后进入第二、三期临床试验,预计将在2006 年左右完成全部临床试验。
5 艾滋病疫苗研制存在的问题及展望
发展艾滋病疫苗是人类彻底征服艾滋病的根本出路, 由于HIV 是一种极为特殊的病毒, 所以, 研制疫苗又有许多前所未有的困难。HIV 对研制疫苗不利的特点有: 被膜尤其是gp120 常发生变异; HIV 的流行毒株有地区差异; HIV 有由类型之分造成的差异; HIV 能进入中枢神经受血脑屏障的阻隔,因而使疫苗难以接近; HIV 侵入部位主要是黏膜, 所以黏膜局部必须免疫; 对病毒感染细胞所致的感染其免疫效果不高;部分抗体能助长HIV 的感染等。此外, HIV 还可以以前病毒形式整合到宿主细胞DNA 中, 受整合的细胞表面却没有HIV的抗原成分, 这样, 刺激机体产生抗体的疫苗对此就无能为力。HIV 的传播在病毒感染中也非常特殊, 对疫苗接种已成功的所有病毒感染, 感染仅由无胞病毒引发, 而HIV 有胞和无胞病毒均可被传播。因为这些特殊性, 所以HIV 疫苗的研制进展缓慢, 现有的疫苗只能抑制HIV - 1 的低水平复制, 还没有产生过针对HIV - 1 原毒株的消毒性免疫应答。目前研制的重点是增加疫苗产生HIV - 1 特异性CTL 及中和抗体的免疫应答能力, 随着对HIV 的生物学特性和宿主对HIV 的免疫反应的深入研究和了解, 人类将不断开发出创新的、改良的新型疫苗, 最终控制艾滋病的传播。